NK細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法需結(jié)合細胞來源、培養(yǎng)體系及目標(biāo)需求設(shè)計，核心步驟涵蓋培養(yǎng)基配制、細胞分離與接種、動態(tài)培養(yǎng)管理三大模塊，以下為具體說明：
一、培養(yǎng)基配制與預(yù)處理
基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇
常用RPMI-1640、DMEM或X-VIVO15等無血清培養(yǎng)基，需添加5%-10%自體血漿或人AB型血清（滅活處理）。例如，X-VIVO15培養(yǎng)基中需補充5%血清，并加入200U/mLIL-2、10ng/mLIL-15及處理的K562細胞。
生長因子組合
核心因子包括IL-2（促進增殖）、IL-15（維持存活）、IL-12（增強抗原敏感性）及IL-21（提升細胞毒性）。例如，HER2單抗誘導(dǎo)體系中，需添加1000-2000IU/mLIL-2、20-40ng/mLIL-12、60-100ng/mLIL-15、30-60ng/mLIL-18。
包被處理
培養(yǎng)容器需提前包被抗CD3抗體或HER2單抗（如1-3mg/mL曲妥珠單抗，37℃包被1-2小時），以增強細胞黏附與激活效率。
二、細胞分離與接種
外周血來源NK細胞分離
通過Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，洗滌后重懸于含5%血清的培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞密度至1×10?cells/mL。
臍帶血來源NK細胞分選
使用CD34陽性選擇磁珠分離造血干細胞/祖細胞，接種于含20ng/mLSCF、10ng/mLIL-15、10ng/mLFLT3L、20ng/mLIL-7的造血干細胞分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)分化為NK細胞。
接種密度控制
初始接種密度建議為1.5-2×10?cells/mL，培養(yǎng)體積根據(jù)容器調(diào)整（如T75培養(yǎng)瓶終體積25mL，細胞培養(yǎng)袋終體積750-1500mL）。
三、動態(tài)培養(yǎng)管理
培養(yǎng)條件
溫度37℃、5%CO?、飽和濕度，每2-3天更換一半體積培養(yǎng)基，補充細胞因子與滅活血漿。例如，第7天轉(zhuǎn)袋后需加入含1000-2000IU/mLIL-2和20-50ng/mLIL-21的培養(yǎng)基。
細胞擴增與監(jiān)測
培養(yǎng)14-21天，期間每2-3天進行細胞計數(shù)與形態(tài)觀察。第10天后按1.5倍補加培養(yǎng)基，第14-15天可收獲1×10?-2×10?cells的NK細胞。
質(zhì)量控制
培養(yǎng)第13天需檢測細菌、內(nèi)毒素與支原體，收獲前通過流式細胞術(shù)鑒定表型（如CD56?CD3?）。若增殖停滯，可加入優(yōu)化劑（如25μL/100mL培養(yǎng)基）。
